前言
臺(tái)灣保健食品市場(chǎng)規(guī)模隨著我國(guó)健康意 識(shí)提升而成長(zhǎng)，2017年通過(guò)審查的保健食品 前五大功效訴求為調(diào)節(jié)血脂、胃腸功能改善、 免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝、骨質(zhì)保健[1]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外 研究顯示乳酸菌有改善腸道菌相、增強(qiáng)免疫 功能、降膽固醇、降血脂或減少體脂肪形成 等功效，食品中常以乳酸菌做為益生菌原料。 隨著國(guó)人生活水平上升，對(duì)於食品衛(wèi)生要求 愈發(fā)嚴(yán)格。檢測(cè)方法進(jìn)行含乳酸活菌產(chǎn)品時(shí)， 若是以PDA為檢測(cè)培養(yǎng)基，檢測(cè)結(jié)果容易因 乳酸活菌生長(zhǎng)於PDA中而有偽陽(yáng)性。目前市 面上已有多種乳酸活菌產(chǎn)品，然而檢驗(yàn)乳酸 活菌產(chǎn)品中黴菌及酵母菌時(shí)，因乳酸活菌能 生長(zhǎng)於PDA上，導(dǎo)致不易判斷產(chǎn)品是否被黴 菌或酵母菌所污染。文獻(xiàn)指出酸可抑制乳酸
菌生長(zhǎng)[2]，而黴菌及酵母菌耐酸性較佳[3]， 因此本研究欲以酸液調(diào)整PDA之 pH值，在 不影響黴菌及酵母菌生長(zhǎng)的前提下，使乳酸 活菌不生長(zhǎng)於PDA上。
材料與方法
培養(yǎng)基、試劑 BD DifcoTM Potato Dextrose Broth（馬 鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基；PDB）、BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth（乳酸桿菌 MRS 培 養(yǎng)基）、BD DifcoTM Agar（洋菜）皆購(gòu)買自 啟新生物科技有限公司，新北市。鹽酸(HCl) 購(gòu)自Sigma-Aldrich（德國(guó)）、85%磷酸(H3PO3) 購(gòu)自第一化工原料股份有限公司（臺(tái)灣）、 檸檬酸(Cirtric acid)購(gòu)自三?；す煞萦邢?公司（中國(guó)）、蘋果酸(Malic acid)購(gòu)自國(guó)華 貿(mào)易股份有限公司（日本）。
10%(w/w)酸液製備 將 37%鹽酸、85%磷酸、檸檬酸粉末、 蘋果酸粉末分別加入無(wú)菌水中混勻至濃度為
10%(w/w)，以0.22 m filter 過(guò)濾至無(wú)菌離 心管內(nèi)備用。
實(shí)驗(yàn)菌種 Lactobacillus plantarum (BCRC 10069)、 Lactococcus lactis (BCRC 12312)、Lactobacillus rhamnosus (BCRC 16000)、Lactobacillus paracasei (BCRC 16100)、Pediococcus pentosaceus (BCRC 10068)、Aspergillus oryzae (BCRC 30289)、Saccharomyces cerevisiae (BCRC 21800)以上菌株皆購(gòu)自財(cái)團(tuán)法人食品 工業(yè)發(fā)展研究所生資中心（新竹，臺(tái)灣）。
菌株活化 乳酸菌菌液製備 : 將乳酸菌冷凍保存管 以無(wú)菌接種環(huán)沾取至Lactobacilli MRS平板 進(jìn)行四區(qū)劃線，倒置37℃於厭氧環(huán)境培養(yǎng) 48±2小時(shí)，培養(yǎng)完畢再將單一菌落以無(wú)菌接 種環(huán)沾取至Lactobacilli MRS Broth中，37℃ 於厭氧環(huán)境培養(yǎng)16~18小時(shí)。 真菌菌液製備 : 將黴菌或酵母菌之純菌 冷凍保存管以無(wú)菌接種環(huán)進(jìn)行四區(qū)劃線接種 至PDA平板，正放25℃培養(yǎng)5-7天，活化後 真菌平板以無(wú)菌接種環(huán)取單一菌落接種至 PDB，培養(yǎng)於25℃培養(yǎng)5-7天備用。
酸化馬鈴薯葡萄糖洋菜培養(yǎng)基（酸化 PDA） 製備 將 PDB 粉末加入總體積2% Agar，以 121℃高溫高壓滅菌15分鐘，冷卻至45-50℃， 加入先前製備好之酸液由pH 5.1調(diào)整pH至 3.8、3.5、3.0與 2.5。 酸化 PDA 配製方法經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 1，不同酸液調(diào)整至pH 3.8 (±0.1)使用酸液量 不同。 由 HCl配製酸化PDA調(diào)整至不同pH值 使用酸量如表2。
乳酸菌數(shù)檢測(cè) 利用傾注平板法進(jìn)行乳酸菌數(shù)計(jì)數(shù)，操 作方法如下：取乳酸活菌菌液1 mL以 1% peptone water 進(jìn)行序列稀釋，稀釋至10-6、 10-7，各稀釋液分別取1mL 至無(wú)菌培養(yǎng)皿， 再倒入15~20 mL經(jīng)滅菌完成冷卻至45-50℃ 之Lactobacilli MRS agar，執(zhí)行平板兩重覆， 待平板冷卻凝固後倒置培養(yǎng)於37℃厭氧環(huán)境 48 ± 2小時(shí)，培養(yǎng)後計(jì)數(shù)平板上的單一菌落， 菌落計(jì)數(shù)範(fàn)圍介於25~250 CFU 之間，兩平 板菌落數(shù)平均後得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
黴菌與酵母菌檢測(cè) 利用傾注法進(jìn)行真菌活性檢測(cè)，操作方 法如下：將活化好之真菌菌液，經(jīng)培養(yǎng)後以 傾注平板法培養(yǎng)於PDA 於 25℃培養(yǎng)5-7天， 觀察生長(zhǎng)活性狀況。
乳酸菌於PDA上生長(zhǎng)活性測(cè)試 同上述乳酸菌檢測(cè)方式，將乳酸菌以傾 注平板法檢測(cè)，培養(yǎng)條件比照黴菌與酵母菌， 培養(yǎng)基使用PDA取代Lactobacilli MRS agar， 倒置培養(yǎng)於25℃培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)後計(jì)數(shù)平 板上的單一菌落，菌落計(jì)數(shù)範(fàn)圍介於25~250 CFU之間，兩平板菌落數(shù)平均後得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
酸性PDA對(duì)於乳酸菌與真菌生長(zhǎng)活性測(cè)試 乳酸菌實(shí)驗(yàn)方法同上述乳酸菌於PDA上 生長(zhǎng)活性測(cè)試，使用培養(yǎng)基為酸化PDA，倒 置培養(yǎng)於25℃培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)後計(jì)數(shù)平板 上的單一菌落，菌落計(jì)數(shù)範(fàn)圍介於25~250 CFU之間，兩平板菌落數(shù)平均後得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 黴菌與酵母菌實(shí)驗(yàn)方法同上述黴菌與酵 母菌檢測(cè)，將黴菌、酵母菌以傾注法於各酸 化PDA，正放於25℃培養(yǎng)5-7天，經(jīng)培養(yǎng)後 觀察菌落型態(tài)生長(zhǎng)活性狀況。
結(jié)果
為評(píng)估乳酸菌於PDA之生長(zhǎng)狀況，本研 究將乳酸菌活化後經(jīng)序列稀釋至適當(dāng)稀釋倍 數(shù)後以傾注培養(yǎng)於MRSA及PDA，結(jié)果如表 3 所示，乳酸菌以傾注平板法接種於 MRS agar 及 PDA，乳酸菌於兩種培養(yǎng)基皆可生 長(zhǎng)，並且其菌落數(shù)目無(wú)明顯差異。乳酸菌於 MRSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)活性較佳，菌落呈白色 明顯肉眼可見(jiàn)，但由於PDA是黴菌與酵母菌 通用培養(yǎng)基，乳酸活菌雖然可以生長(zhǎng)於此培 養(yǎng)基上，但對(duì)於部分乳酸菌較為不適，而生 長(zhǎng)出的乳酸菌菌落形態(tài)會(huì)偏細(xì)小，較不易計(jì) 數(shù)。 藉由不同酸液調(diào)整至 pH 3.8之 PDA 確 認(rèn)乳酸菌於一般酸化PDA生長(zhǎng)活性。由表4 結(jié)果顯示部分乳酸菌由調(diào)整至pH 3.8 PDA傾 注培養(yǎng)幾乎沒(méi)有活性，但是 Lactobacillus plantarum 較為耐酸，活性較強(qiáng)，於 pH 3.8 之 PDA中菌數(shù)與MRS agar中菌數(shù)無(wú)明顯差 異。 以不同酸液調(diào)整pH值之PDA皆可抑制 大部份乳酸菌的生長(zhǎng)（表4）。以此結(jié)果可 推斷以調(diào)整 pH 方式可以抑制乳酸菌生長(zhǎng)活 性，以 pH 值 3.8之 PDA 雖然可降低大部分 乳酸菌活性，但還是有耐酸特性較強(qiáng)的乳酸 菌無(wú)法被抑制，故以 pH 3.8之酸化 PDA 不 足以客觀表現(xiàn)乳酸活菌產(chǎn)品之衛(wèi)生檢測(cè)結(jié)果。
討論
依據(jù)本研究結(jié)果乳酸菌於PDA上生長(zhǎng)活 性測(cè)試結(jié)果證明乳酸活菌可被PDA檢出來(lái)。 若以無(wú)經(jīng)處理之PDA檢測(cè)含活性乳酸菌之產(chǎn) 品，檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)有偽陽(yáng)性，進(jìn)而影響品 管檢驗(yàn)判定。為使品管檢驗(yàn)更加準(zhǔn)確，必須 開(kāi)發(fā)抑制乳酸菌於PDA之生長(zhǎng)活性方法。本 研究以一般酸化PDA (pH 3.8)確實(shí)可抑制乳 酸菌生長(zhǎng)活性，但有部分乳酸菌耐酸度較強(qiáng)， pH 3.8亦可生長(zhǎng)。由此可知酸化是一個(gè)有效 且可行的方法，但需再作改善，經(jīng)由再降低 pH至 3.5-2.5的PDA確實(shí)能有效抑制乳酸菌 活性，且不影響黴菌與酵母菌生長(zhǎng)活性，因 此，將PDA酸化至pH 3.5-2.5範(fàn)圍內(nèi)後再檢 驗(yàn)含乳酸活菌產(chǎn)品，可以使衛(wèi)生檢驗(yàn)結(jié)果降
低其偽陽(yáng)性而更加準(zhǔn)確。本研究使用一株酵 母及一株黴菌做為測(cè)試基準(zhǔn)，未來(lái)將進(jìn)一步 測(cè)試多種真菌於酸化PDA生長(zhǎng)情形，以確認(rèn) 酸化PDA檢驗(yàn)適用性。
參考文獻(xiàn)
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